【摘要】目的探讨T、B和NK淋巴细胞亚群相关指标对脓毒症患者不良预后的预测价值。 方法应用前瞻性研究方法，选取宁夏人民医院急诊重症监护室（EICU）及ICU共101例脓毒症患者为对象，检测入院48 h内外周血T、B和NK淋巴细胞亚群相关指标水平，随访至出院，观察指标异常对死亡结局的危险度，评估各指标联合检测对死亡风险的预测价值。结果脓毒性休克患者CD3、CD3+/CD4+低于脓毒症组和严重脓毒症组，严重脓毒症和脓毒性休克患者CD3+/CD8+，CD3-/CD19+，CD4+/CD8+低于脓毒症组，CD（16+56）+高于脓毒症组（P<0.05）;死亡患者的单核细胞高于生存患者，CD3、CD3-/CD19+、CD3+/CD4+、CD4+/CD8+低于生存患者（P<0.05）;CD3-/CD19+、CD3+/CD8、CD4+/CD8+为脓毒症预后的保护因素，OR值分别0.235、0.006、0.108;淋巴细胞亚群联合预测因子、APACHE Ⅱ评分、SOFA评分对死亡风险预测效能的ROC曲线下面积分别为0.993、0.877、0.848;淋巴细胞亚群联合判别函数对病情程度的误判率为19.8%，对患者结局的误判率为4%。结论脓毒症患者淋巴细胞亚群表达异常，淋巴细胞亚群的联合检测对脓毒症患者的病情及预后有指导价值。
【关键词】脓毒症;淋巴细胞亚群;预后;前瞻性研究
Value of lymphocyte subgroups jointly detected in assessing poor prognosis of patients with sepsis
Pan Dongfeng，Li Furong，Liang Shisong，Qi Kele，Ji Xinzhong，Ke Jinfang. Emergency Department，Ningxia People’s Hosptial，Yinchuan 750021，China
Corresponding author：Pan Dongfeng，Email：doctor_pf@126.com
【Abstract】ObjectiveTo investigate the predictive value of T， B， and NK lymphocyte subsets jointly detected in poor prognosis in patients with sepsis.MethodsTotally 101 patients with sepsis were enrolled for prospective study. The percentages of lymphocyte sub-populations in peripheral blood were detected within 48 h after admission. The outcomes of patients during hospitalization were observed by follow-up study. The predictive value of lymphocyte sub-populations jointly detected in death risk was assessed. Results The percentages of CD3， CD3+/CD4+ in patients with septic shock were lower than those in patients with mild/moderate sepsis and severe sepsis. The percentages of CD3+/CD8+， CD3-/CD19+， CD4+/CD8 + in patients with severe sepsis and septic shock were lower than those in patients with mild/moderate sepsis. The percentage of CD （16+56）+ in severe sepsis and septic shock was higher than that in mild/moderate sepsis group （P<0.05）. The total number of monocytes in the deaths was higher than that in survivals. The percentages of CD3， CD3-/CD19+， CD3+/CD4+， CD4+/CD8+ were lower in deaths than those in survivals （P<0.05）. The CD3-/CD19+， CD3+/CD8 and CD4+/CD8+ were protective factors against sepsis with their OR values of 0.235， 0.006 and 0.108， respectively. The ROC curve of lymphocyte subsets jointly detected， APACHE Ⅱ score and SOFA score to predict the risk of death were 0.993， 0.877 and 0.848， respectively. The misjudgment rate of discriminating disease severity function of lymphocyte subgroups jointly detected was 19.8%， and that of outcomes was 4%. ConclusionThe percentages of lymphocyte sub-populations in patients with sepsis is abnormal， and therefore， the lymphocyte subgroups jointly detected has value in the judgment of disease severity and prognosis in patients with sepsis. 【Key words】Sepsis;Lymphocyte subsets;Prognosis;Perspective study
脓毒症为感染或创伤等引起的全身性炎症反应综合征，其发生率高，病情凶险，病死率高<sup>[1]</sup>。据国外流行病学调查显示，脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏患者死亡的主要原因<sup>[2-4]</sup>。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，但脓毒症的病死率仍高达30%～70%<sup>[5]</sup>。炎性细胞的大量释放、免疫细胞的凋亡是引发脓毒症及脓毒性休克的重要机制<sup>[6]</sup>，因此，研究人员在对脓毒症患者抗炎治疗的同时进行尝试性的免疫调节，但效果均不理想。通过反应机体免疫状态相关指标的检测，观察其与脓毒症患者预后的相关性将对明确患者治疗预期以及临床治疗提供指导。本研究将研究外周血淋巴细胞亚群在脓毒症患者中的表达水平，观察各指标对患者不良预后风险的评估价值。
1资料与方法
1.1一般资料
2012年3月至2013年12月宁夏人民医院急诊重症监护室（EICU）及ICU脓毒症患者共101例，其中男60例，女41例，年龄24～77岁，（54.22±11.97）岁。排除肿瘤、自身免疫性疾病及使用免疫抑制剂患者。所有患者诊断和治疗严格遵守2012年美国重症监护医学会（SCCM）“严重脓毒症与脓毒性休克治疗国际指南”<sup>[7]</sup>。以出院时患者生存状态将患者分为存活组和死亡组，患者临床特征见表1。研究方案经医院医疗伦理委员会批准实施，患者或家属对研究知情同意，并签署知情同意书。
1.2检测方法及指标
所有患者入院后行APACHE Ⅱ评分、SOFA评分，于入院48 h内，清晨空腹抽取外周静脉血2 mL，样本在6 h内测定，应用BD FACSAria Ⅱ流式细胞分选仪分析淋巴细胞亚群百分比，各检测项目参考值如下：总T淋巴细胞（CD3+）：50%～82%，总B淋巴细胞（CD3-/CD19+）：5%～21%，T辅助/调节淋巴细胞（CD3+/CD4+）：24%～54%，T抑制/细胞毒淋巴细胞（CD3+/CD8+）：14%～41%， T淋巴细胞H/S比值（CD4+/CD8+）：0.7～3.1，总NK淋巴细胞[CD（16+56）+]：6%～38%。流式细胞仪检测单核细胞水平[正常值（0.10～0.60）×109 L-1]。
1.3统计学方法
采用spss 17.0、Medcalc统计分析软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，数据经正态分布、方差齐性检验以及适当的数据转换后，采用成组t检验或方差分析后的LSD-t两两检验比较组间差异;计数资料以频数（率）表示，采用检验比较不同组间差异;应用多因素Cox回归分析不同临床特征下的死亡风险;应用主成分分析提取淋巴细胞亚群指标的综合函数值后采用受试者工作曲线（ROC）分析法比较其对死亡预测的灵敏度和特异度;应用判别分析评估淋巴细胞亚群预测脓毒症病情程度及死亡风险的价值。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1患者临床特征
存活组和死亡组脓毒症患者在年龄、性别、病因、病原微生物类型比较差异无统计学意义（P>0.05）;死亡组患者严重脓毒症和脓毒性休克患者比例高于存活组，APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、ICU住院天数、总住院天数均高于存活组，差异有统计学意义（P<0.05），结果见表1。
2.2脓毒症患者淋巴细胞亚群表达水平
按脓毒症患者病情严重程度进行分组，比较不同组间淋巴细胞亚群表达水平，结果显示，各组间单核细胞绝对值差异无统计学意义（F=1.894，P=0.154）;CD3（F=5.887，P=0.004），CD3+/CD8+（F=5.858，P=0.004），CD3+/CD4+（F=6.986，P=0.001），CD3-/CD19+（F=22.768，P<0.01），CD4+/CD8+（F=14.142，P<0.01）， [CD（16+56）+]（F=25.382，P<0.01）差异均有统计学意义，经LSD两两比较发现，脓毒性休克患者CD3、CD3+/CD4+低于脓毒症组和严重脓毒症组（P=0.001， P=0.016），严重脓毒症和脓毒性休克患者CD3+/CD8+（P=0.031，P=0.003），CD3-/CD19+（均P<0.01），CD4+/CD8+（P<0.01，P=0.001）低于脓毒症组，CD（16+56）+高于脓毒症组（P<0.01）;比较生存患者与死亡患者各指标的差异，结果显示，严重脓毒症患者中，死亡患者的单核细胞高于生存患者（t=9.280，P=0.005），CD3（t=14.087，P=0.001）、CD3-/CD19+（t=16.947，P<0.01）、CD4+/CD8+（t=18.723，P<0.01）低于生存患者;脓毒性休克患者中，死亡患者的CD3+/CD4+低于生存患者（t=10.198，P=0.009）。结果见表2。
2.3患者临床特征与生存状态的多因素Cox回归分析
以患者临床特征等因素为自变量，出院时患者生存状态为因变量（死亡=1，生存=2），建立Cox回归模型，结果显示APACHE Ⅱ评分（连续性变量）为独立危险因素，CD3-/CD19+（<5%=1，≥5%=2）、CD3+/CD8（<14%=1，≥14%=2）、CD4+/CD8+（<0.7%=1，≥0.7%=2）为保护因素，OR值分别1.645、0.235、0.006、0.108，结果见表3。 2.4淋巴细胞亚群预测脓毒症死亡的ROC曲线
考虑到各淋巴细胞亚群间存在相关性，应用主成分分析提取各指标的贡献率，并构造综合评价函数形成淋巴细胞亚群综合预测因子，函数表达式为：
淋巴细胞亚群综合预测因子=0.25683×FAC1_1+0.22566×FAC2_1 + 0.20982×FAC3_1
FAC1_1主成分包括单核细胞、CD3+，是反映总T淋巴细胞的指标;FAC2_1主成分包括CD3-/CD19+，反映总B淋巴细胞;FAC3_1主成分包括CD3+/CD4+，反映T辅助/调节淋巴细胞。依据新的变量构建ROC曲线，结果显示，淋巴细胞亚群综合预测因子、APACHE Ⅱ评分、SOFA评分的ROC曲线下面积分别为0.852、0.877、0.848，结果见图1和表4。
2.5淋巴细胞亚群预测脓毒症病情程度及死亡风险的判别分析
采用逐步判别法对脓毒症患者的分类建立判别函数：
函数1=0.025（CD3+）+0.304（CD3-/CD19+）+0.110（CD3+/CD4+）-0.128[CD（16+56）+]-2.883;函数2=0.065（CD3+）-0.088（CD3-/CD19+）+0.184（CD3+/CD4+）+0.084[CD（16+56）+]-10.456
采用刀切法进行判别，结果显示，综合误判率为19.8%，其中脓毒症组误判率为10.6%，严重脓毒症组为38.7%，脓毒性休克组为15.4%，判别函数图见图2。
对患者生存与死亡结局建立判别函数：
函数=-2.667×单核细胞+0.051（CD3+）+0.329（CD3-/CD19+）+0.163（CD3+/CD4+）+1.908[CD（16+56）+]-10.741;
结果显示，综合误判率为4%，其中生存误判率为9.5%，死亡误判率为2.5%，判别函数图见图3和图4。
3讨论
淋巴细胞亚群是评价患者机体免疫功能是否处于平衡状态的一系列指标。脓毒症是一个促炎和抗炎病理机制交替的复杂免疫过程<sup>[8]</sup>。早期的脓毒症表现为明显的炎性反应，随着抗炎因子的增多，脓毒症患者进入长期的免疫抑制阶段，其以细胞吞噬机制受损，单核细胞抗原表达紊乱以及淋巴细胞的凋亡等为特点，各机制的综合作用最终导致先天和适应性免疫机制失调和紊乱<sup>[9]</sup>。Inoue等<sup>[10]</sup>研究发现，脓毒症患者与健康对照组相比， CD3+和CD4+ T淋巴细胞的百分比和绝对数量均显著降低， CD8 T淋巴细胞、NK细胞绝对数、CD4 / CD8比值降低，B淋巴细胞的比例增加。国内研究发现，脓毒症患者CD3、CD19+、CD3+/CD4+、CD4+/CD8+较健康对照组降低，CD（16+56）+升高，且随着病变程度的加重，各指标变化幅度增大<sup>[11]</sup>，免疫调节治疗可下调调节性T细胞CD4+C125+Tregs，上调总淋巴细胞数、CD4+/CD8+比值而改善患者预后<sup>[12]</sup>，提示淋巴细胞亚群指标与患者的病情程度密切相关。本组研究发现，较正常参考值比较，脓毒症患者表现为CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞以及CD19+ B淋巴细胞的下降，CD（16+56）+总NK淋巴细胞的升高，且严重脓毒症患者，特别是脓毒性休克患者较脓毒症患者的各指标变化更为明显，该研究结果与既往研究相近。说明脓毒症患者存在淋巴细胞增殖能力下降，辅助型淋巴细胞受到抑制的现象;严重脓毒症患者CD（16+56）+明显偏高，可能与外周血CD4+T淋巴细胞的大量凋亡抑制B淋巴细胞（CD19+）或T淋巴细胞的增殖与激活有关<sup>[13-14]</sup>。
淋巴细胞亚群的联合检测不但可反映患者机体的免疫状况，它还可间接用于预测患者的死亡风险。本研究比较了生存患者与死亡患者各淋巴细胞亚群指标发现，死亡患者CD3、CD3-/CD19+、CD3+/CD4+、CD4+/CD8+低于生存患者。多因素Cox回归分析结果显示，CD3-/CD19+、CD3+/CD8、CD4+/CD8+水平正常的脓毒症患者死亡风险将降低，其OR值分别为0.235、0.006、0.108。通过诊断试验的评价指标，国内研究证实，CD3+、CD4+、CD19+、CD16+CD56+预测脓毒症死亡的ROC曲线下面积达0.465～0.719，各指标预测脓毒症死亡的精度较高<sup>[11]</sup>。但由于淋巴细胞亚群各指标间存在相关性，本研究应用主成分分析提取了淋巴细胞亚群的联合预测因子，结果显示，淋巴细胞亚群联合预测因子对患者死亡风险预测的ROC曲线下面积为0.852，其与APACHE Ⅱ评分、SOFA评分的预测结果相近，后两者分别为0.877、0.848;为了能更准确评估淋巴细胞亚群的联合检测在判断患者死亡风险上的预测价值，研究通过判别分析对其预测价值进行量化，获得的患者结局的判别函数的综合误判率仅为4%，上述研究结果均提示淋巴细胞亚群联合对患者的死亡风险有良好的预测价值。同时，笔者还通过判别函数对患者的病情严重程度分组进行了判别，结果显示，综合误判率为19.8%，其中脓毒症组误判率为10.6%，严重脓毒症组为38.7%，脓毒性休克组为15.4%，提示淋巴细胞亚群的联合检测也可用于评估脓毒症患者的病情程度。考虑到单核细胞具有明确的免疫辅助与免疫调节功能，且其在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，具有诱导淋巴细胞的特异性免疫反应的作用，因此本研究在评估淋巴细胞亚群的临床价值时纳入了单核细胞绝对值。 综上所述，笔者认为，脓毒症患者存在淋巴细胞增殖能力下降，辅助型淋巴细胞免疫抑制的现象，且其波动程度与病情相关;淋巴细胞反应异常与患者死亡风险存在相关性，淋巴细胞亚群联合检测可用于评估患者病情及死亡风险。由于客观因素的影响，本次研究尚存在一定局限性，如研究未考虑治疗对患者免疫状况的影响，各指标的动态变化对预后的评估是否更有价值，值得进一步研究确定。同时，为获得相对可靠的结论，本研究应用APACHE Ⅱ评分和SOFA评分双评分系统来评估死亡风险的预测价值，此设计并未考虑到成本-收益的性价比。
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