郭菊卉，田 娟，石桃雄，陈庆富
（贵州师范大学荞麦产业技术研究中心／生命科学学院植物遗传育种研究所，贵阳 ５５０００１）
摘要：以贵州师范大学荞麦产业技术研究中心建立的两个甜荞（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）重组自交系群体（Ｈｏｍｏ×甜自１００和Ｌｏｒｅｎａ－３×甜自２１－１）的亲本为研究对象，选取了５个多态性好、带型清楚的随机引物进行ＲＡＰＤ分析，计算了每对亲本之间的相似度系数，并构建了各亲本的ＲＡＰＤ指纹图谱。结果表明，在Ｈｏｍｏ×甜自１００和Ｌｏｒｅｎａ－３×甜自２１－１的亲本中，平均相似度系数分别为３９．１３％和４２．６９％；在构建的ＲＡＰＤ指纹图谱中，有２９条谱带为Ｈｏｍｏ（Ｐ１）所独有，２７条谱带为甜自１００（Ｐ２）所特有；有２６条谱带为Ｌｏｒｅｎａ－３（Ｐ１）所独有，２５条谱带为甜自２１－１（Ｐ２）所特有。荞麦特异谱带可以作为品种鉴定的分子标记。
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关键词 ：甜荞（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）；ＲＡＰＤ；多样性；ＤＮＡ指纹图谱
中图分类号：S517 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）02－0284-05
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.008
甜荞（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）为荞麦大粒组类群７个生物学物种之一［１］。Ｃｈｅｎ［２，３］的试验研究表明，普通荞麦中存在着大量的形态变异，而对这些变异进行深入研究将在很大程度上有利于遗传育种。基因控制着生物体的性状表达和变异，研究ＤＮＡ分子的多态性也会促进对形态变异的进一步探索，并在遗传育种中为选择强优势组合的亲本进行杂交和荞麦资源的鉴定提供科学依据［４］。
ＲＡＰＤ技术是以ＰＣＲ为基础的一项检测物种ＤＮＡ多态性的分子技术［５］。该技术的优点是ＤＮＡ样品需求量小；无种属和基因组结构特异性，一套引物可用于不同生物基因组分析；试验成本低；试验技术简单，检测速度较快。ＲＡＰＤ在荞麦中应用主要集中在荞麦的遗传多样性和种间系统关系研究方面［６］。通过建立ＲＡＰＤ指纹图谱，寻找每个种类的恒定谱带和独特谱带，可以迅速准确地对荞麦种类进行鉴别。近年来，ＲＡＰＤ技术已应用于多种植物杂交组合后代鉴定［７，８］和种子纯度的检测等。Ｏｈｉｎｓｈｉ等［９］、Ｔｓｕｊｉ等［１０］利用ＡＦＬＰ和ＲＡＰＤ技术研究苦荞栽培品系和天然种群间的系统发育关系。Ｓｈａｒｍａ［１1］应用ＲＡＰＤ技术研究了荞麦属１４个种之间的遗传多样性。Ｋｕｍｐ等［１2，１3］采用ＲＡＰＤ技术进行了苦荞３３个栽培种之间遗传关系的分析。许瑾等［４］利用ＲＡＰＤ技术对荞麦属的９个品种进行基因组指纹图谱分析。谭萍等［１4］采用ＲＡＰＤ方法对国内１０个荞麦栽培种进行基因型分析，并建立了指纹图谱。Ｐａｎ等［１5］以Ｆ． ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｏｅｎｃｈ， Ｆ． ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｖａｒ． ｈｏｍｏｔｒｏｐｉｃｕｍ 及其杂交所建立的 ２２５ 株 Ｆ２代分离群体为材料，进行了 ＲＡＰＤ 与 ＳＴＳ 标记分析和重要形态性状遗传分析，并由此构建遗传标记连锁图谱，共涉及８７个ＲＡＰＤ标记，１２个ＳＴＳ标记。覆盖基因组长度６５５．２ ｃＭ。总的说来，由于普通荞麦自交不亲和，相关研究主要以荞麦品种或品系为材料，主要运用ＲＡＰＤ等标记。
在重组自交系中，利用亲本ＤＮＡ样品进行ＲＡＰＤ 标记引物筛选，并将重复性好的引物进行其可育Ｆ２代分离群体样本的ＰＣＲ扩增，用以分析甜荞ＲＡＰＤ标记多态性和构建起分子遗传连锁图谱。本研究对普通荞麦重组自交系群体亲本组合（Ｈｏｍｏ×甜自１００，Ｌｏｒｅｎａ－３×甜自２１－１）的亲本用５种随机引物的ＲＡＰＤ谱带进行多态性分析和指纹图谱建立，以期为其Ｆ２代自交系群体的进一步研究打下基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
本研究选用了甜荞重组自交系的４个亲本甜荞种，分别为Ｌｏｒｅｎａ－３、甜自２１－１、甜自１００和Ｈｏｍｏ。重组自交系的亲本组合为：Ｈｏｍｏ×甜自１００，Ｌｏｒｅｎａ－３×甜自２１－１。甜荞品种由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心提供。
１．２ ＤＮＡ提取
取２～３周苗龄的新鲜健康叶片约３００ ｍｇ置于研钵中，倒入液氮，研成粉末。将该粉末直接转入装有预热的含有１５ μＬ β－巯基乙醇的１ ０００ μＬ ２％ ＣＴＡＢ提取缓冲液（质量浓度２％ ＣＴＡＢ，１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ８．０ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ－Ｎａ２，１．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，质量浓度２％ ＰＶＰ）的５ ｍＬ离心管中，轻轻摇动使其充分混匀，置于６５ ℃水浴中保温６０ ｍｉｎ（每隔２０ ｍｉｎ轻轻颠倒混匀１次），加入酚／氯仿／异戊醇混合液（２５∶２４∶１，Ｖ／Ｖ／Ｖ），充分混匀，常温下静置１０ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ。将上清液加入氯仿／异戊醇混合液（２４∶１，Ｖ／Ｖ），轻轻混匀，室温下１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ。将上清液转移到干净的离心管中，加入２倍体积－２０ ℃冰冻的无水乙醇，轻轻颠倒离心管直至出现白色絮状沉淀，将离心管放在 －２０ ℃中沉淀１０ ｍｉｎ。离心沉淀ＤＮＡ并将沉淀用 －２０ ℃冰冻的体积分数为７０％的乙醇洗涤两次，在室温下使ＤＮＡ沉淀干燥。加入６００ μＬ ＴＥ缓冲液，完全溶解后，置于－２０ ℃冰箱保存备用。
１．３ 引物
共使用了５个随机引物，各引物序列见表１。该引物从贵州师范大学荞麦产业技术研究中心设计的２５个引物中选取，以亲本间多态性好、电泳带型清晰、重复性好为主要筛选原则。
１．４ ＰＣＲ反应体系
试验中，ＲＡＰＤ检测使用的ＰＣＲ反应体系见表２。ＰＣＲ反应程序为：９４ ℃预变性１０ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，Ｔｍ（引物不同温度不同）退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，３８个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。
１．５ 统计分析方法
扩增产物于０．８％的琼脂糖凝胶中电泳，在ＢｉｏＳｅｎＳＣ８０５型全自动凝胶成像系统的Ａｎａｌｙｓｉｓ工具栏中，点击消除背景图标以消除图像本底的干扰；点击自动检测所有泳道的条带图标以进行各泳道内条带检测；点击相对分子质量计算图标，以Ｍａｒｋｅｒ泳道内的Ｍａｒｋｅｒ条带的相对分子质量为标准设定相对分子量曲线图，关闭Ｍａｒｋｅｒ窗口，则会显示各个条带的相对分子质量，统计各泳道内的条带数。
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参考文献［１6］，采用条带相似度系数分析条带的多样性。相似度系数ＳＤ＝（２ｎＡＢ）／（ｎＡ＋ｎＢ），ｎＡ为Ａ泳道内的ＤＮＡ条带数，ｎＢ为Ｂ泳道内的ＤＮＡ条带数，ｎＡＢ是Ａ、Ｂ泳道内共有的条带数。
２ 结果与分析
２．１ 亲本甜荞的ＲＡＰＤ电泳图谱
不同引物扩增的亲本甜荞的ＲＡＰＤ电泳图谱如图１和图２所示。
２．２ 亲本甜荞ＲＡＰＤ标记的多样性分析
根据筛选出的５个随机引物的ＲＡＰＤ扩增结果，可以对每对杂交组合中的两个亲本进行扩增条带的多样性分析，两对杂交组合亲本中各引物的扩增情况与相似度系数见表３和表４。
由表３可知，对亲本Ｈｏｍｏ（Ｐ１）×甜自１００（Ｐ２）的组合进行ＲＡＰＤ扩增，５个引物共扩增出９２条谱带，平均每个随机引物产生了１８．４条谱带。这些引物的扩增产物为１７～２０条谱带，其中扩增条带数目最多的是引物Ｒ１１８２，共有２０条谱带；其次为引物Ｒ５２和Ｒ４２８，均为１９条谱带；最少的为引物Ｒ４１和Ｒ３５３，扩增出１７条谱带。
对亲本Ｈｏｍｏ（Ｐ１）×甜自１００（Ｐ２）组合的所有随机引物的ＲＡＰＤ标记多样性进行检测，结果（表３）表明，在５个随机引物获得的９２条谱带中，有１８条谱带在两亲本间表现为相同谱带，ＲＡＰＤ标记的相似度系数为３９．１３％（３６／９２）。对于每一条引物的相似度系数来说，其变化范围为３１．５８％（６／１９）～５０．００％（１０／２０）。其中ＲＡＰＤ标记的相似度系数最高的引物是Ｒ１１８２，达到了５０．００％，引物Ｒ４２８的标记相似度系数最低，为３１．５８％（６／１９）。因此，本研究所采用的杂交组合亲本Ｈｏｍｏ（Ｐ１）×甜自１００（Ｐ２）在基因组ＤＮＡ水平上存在较低的ＲＡＰＤ标记相似度系数，即ＤＮＡ水平上条带的多样性较为丰富。有利于其子代群体获得更为广泛的性状变异。
由表４可知，对亲本Ｌｏｒｅｎａ－３（Ｐ１）×甜自２１－１（Ｐ２）的组合进行ＲＡＰＤ扩增，５个引物共扩增出８９条谱带，平均每个随机引物产生了１７．８条谱带。这些引物的扩增产物为１５～２０条谱带，其中扩增条带数目最多的是引物Ｒ１１８２，共有２０条谱带；而后依次为Ｒ５２、Ｒ３５３、Ｒ４１、Ｒ４２８，扩增出的谱带数分别为１９、１８、１７、１５。
对Ｌｏｒｅｎａ－３（Ｐ１）×甜自２１－１（Ｐ２）的亲本组合所有随机引物的ＲＡＰＤ标记多样性进行检测，结果（表４）表明，在５个随机引物获得的８９条谱带中，有５１条谱带在两亲本间的表现存在差异性，ＲＡＰＤ标记的相似度系数为４２．６９％（３８／８９）。对每条引物的标记相似度系数来说，其变化范围为４０．０％（６／１５）～４７．０６％（８／１７）。其中ＲＡＰＤ标记的相似度系数最低的引物为Ｒ４２８和Ｒ１１８２，相似度系数为４０．００％，Ｒ４１的标记相似度系数最高，达４７．０６％（８／１７）。因此，本研究所采用的杂交组合亲本Ｌｏｒｅｎａ－３（Ｐ１）×甜自２１－１（Ｐ２）基因组ＤＮＡ水平上同样存在较低的ＲＡＰＤ标记相似度，也存在较高的多样性，将有利于其子代群体获得更为广泛的性状变异。
２．３ 亲本甜荞的ＲＡＰＤ指纹图谱
根据全部随机引物扩增产物的数据统计分析结果，将能在亲本组合中稳定扩增出现的、且具有差异的特异性谱带用来构建亲本组内Ｐ１和Ｐ２的ＲＡＰＤ标记指纹图谱。在Ｈｏｍｏ（Ｐ１）×甜自１００（Ｐ２）的亲本中，共扩增出５６条差异性谱带（表５）；在Ｌｏｒｅｎａ－３（Ｐ１）×甜自２１－１（Ｐ２）的亲本中，共扩增出５１条差异性谱带（表６）。
由表５和表６可知，Ｈｏｍｏ（Ｐ１）×甜自１００（Ｐ２）和Ｌｏｒｅｎａ－３（Ｐ１）×甜自２１－１（Ｐ２）组合亲本ＲＡＰＤ指纹图谱存在较明显的差异性。前者中有28条谱带为Ｈｏｍｏ（Ｐ１）所独有，２７条谱带为甜自１００（Ｐ２）所特有；后者中有２4条谱带为Ｌｏｒｅｎａ－３（Ｐ１）所独有，２4条谱带为甜自２１－１（Ｐ２）所特有。因此，在每对杂交组合中，存在差异的谱带可看作是两亲本的特征性谱带，而由ＲＡＰＤ指纹图谱所反应的这些特征谱带可以作为鉴别亲本的依据，也可为进一步对杂交组合中亲本的ＤＮＡ多态性及其他分子遗传研究打下基础。
３ 讨论
Ｄｅｎｇ等［17］利用７个随机引物对１９个荞麦（包括甜荞和苦荞）品种进行ＲＡＰＤ分析，结果表明其平均多态性达９４．８９％，而本研究结果表明，甜荞重组自交系的两对亲本组合的平均相似度系数分别为３９．１３％（Ｈｏｍｏ×甜自１００）和４２．６９％（Ｌｏｒｅｎａ－３×甜自２１－１），再次在ＤＮＡ水平上说明荞麦种间的多态性远高于种内多态性。同时，对同属甜荞品种的两个亲本组合而言，其低于５０％的相似度系数也从ＤＮＡ的角度解释了甜荞异花授粉、自交不亲和等生殖学特征所带来的物种基因重组的多态性现象。在对荞麦进行种类划分的研究中，部分种类难以从形态学上进行识别，分类特征也常存在较大变异，难以把握。本研究在ＤＮＡ水平上进行的ＲＡＰＤ遗传标记分析可对荞麦品种鉴别和遗传歧化研究提供依据。
此外，本研究以重组自交系亲本为研究对象进行ＲＡＰＤ分析，发现自交系群体亲本之间存在较多的特异ＲＡＰＤ谱带，也可为以重组自交系为研究对象进行的相关农艺学特征遗传及分子标记研究奠定基础。
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