周雪花
云南省文山州疾病预防控制中心，云南文山 663000
[摘要] 目的 探讨实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用效果。方法 选取2009年9月—2013年12月在我州采集的流感样病例咽拭子2489件进行分析，采用实时荧光定量PCR对流感病毒核酸进行检测，观察检测阳性率和阳性样本的类型，以分析流感的流行趋势。结果 2009年9月—2013年12月共检出流感病毒核酸阳性676件，检测阳性率为27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季节性甲3亚型病毒126件，占7.54%；季节性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。每年6~9月甲型H1N1病毒流感呈上升趋势，在10~11月达到高峰期；6~9月以季节性甲3亚型病毒为主要流行病株，10~11月甲型H1N1病毒成为主要流行病株。结论 实时荧光定量PCR是一种科学有效的检测方法，可对流感病毒核酸进行快速、准确的检测，分析流感病毒的流行规律，有效预防突发公共卫生事件的发生。
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关键词 ] 实时荧光定量PCR；流感；病毒核酸；检测；应用
[中图分类号] R440 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）10（a）-0178-02
[作者简介] 周雪花（1977-），女，汉族，本科，主管检验师，云南文山人，主要从事临床检验，微生物检验工作。
2009年3月份在墨西哥爆发甲型H1N1流感，并且迅速蔓延至全球，使人们意识到预防流感的重要性[1-2]。为了探讨实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用效果，本文选取2009年9月—2013年12月在我市某地区采集的流感样病例咽拭子2489件作为研究对象进行分析，结果汇报如下。
1资料与方法
1.1一般资料
资料来源于2009年9月—2013年12月在我州采集的流感样病例咽拭子2489件。
1.2方法
1.2.1采集2489件咽拭子是擦拭双侧咽扁桃体和咽后壁，剪去一部分放置在无菌病毒采样液中，以4℃的条件下保存，尽快送至实验室，其中疑似甲型H1N1病毒的病例采用A类包装。
1.2.2试剂和仪器采用STRATAGENE MX3000P 实时荧光定量PCR仪。试剂盒采用QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit(Catalog#74104)病毒核酸提取试剂盒，及其配套的试剂，其阳性检测结果对比参照试剂盒配套说明书。
1.2.3检测方法RT-PCR快速检测试验步骤
（1）流感病毒核酸提取—QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit(Catalog#74104)：①取一支无菌、无酶的1.5ml Eppendorf管，加入500ul RLT。②取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）100uL，加入上述Eppendorf管中。③加5uL β-巯基乙醇，充分混匀。④加600uL 70%乙醇，于旋转混合器混匀。⑤从试剂盒中取出带滤膜的离心柱，并标上标本号。⑥将第4步的混合液分两次（每次600uL）吸入于滤柱中，12000rpm离心15 s，弃收集管中的离心液。⑦滤柱仍放回收集管上，将第4步的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm离心15 s，弃收集管中液体。⑧于滤柱中加入700uLRW1，12000rpm离心15 s。⑨从试剂盒中取出一支新的2 mL收集管，将离心后的滤柱转到新的收集管上，于柱子中加入500ulRPE，12000rpm离心15 s弃收集管中液体。⑩滤柱放回收集管上，于滤柱中加入500uL RPE，13000~14000rpm离心2 min。 从试剂盒中取出一支1.5mL Eppendorf管，将滤柱转到新的1.5mL管上，于滤柱中加入30~50uL无RNA酶的水，室温静置1~3 min。 12000rpm离心1 min，弃滤柱。收集的离心液即为提取病毒的RNA，可以直接用于逆转录实验，或在-20℃以下保存，-30℃可保存3~4个月。
注意事项：①试剂盒中的RPE液用前需加44 mL无水乙醇，使终体积达到55 mL；②所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜；③每步均需要更换枪头。
（2）在洁净缓冲间、二级生物安全柜配制RT—PCR(realtimePCR)反应液。（以下均存-20℃）：
①一对特异引物和寡核苷酸探针（季节性FLuA、FLuB、H1、H3、H5、H7、H9等）。
手掌型离心机离心15～20 s后（防止突然开盖引物和探针飘走），按各自标注的OD值加入无酶水，混匀，离心即为储备液。依据说明书，各相应的一对特异引物（F、R）按2.5倍稀释、寡核苷酸探针（P）按5倍（有的为10倍稀释）即为使用液
②各季节性流感反应体系（按n+2用量配制）及其反应条件(需根据引物调整)。
RT-PCRMasterMix 12.5uL 60℃ 5min/50℃ 30min/95℃ 15min(1个循环)
RT-Mix 0.25uL 95℃ 15s/55℃ 30s/(收集荧光)/72℃ 30 s
DH2O5.75uL（45个循环）
F(5′上游引物使用液) 0.5uL 72℃ 5 min（1个循环）
R(3′下游引物使用液) 0.5uL
P（寡核苷酸探针使用液）0.5uL
③新甲型H1N1(猪甲流-2009)—北京金豪试剂反应体系（按n+2用量配制）及其反应条件。
H1N1各反应液2000 rpm离心10 s50℃30min/ 95℃3 min（1个循环）
（FLuA、SWH1、SWF FLuA、RNP内标）各20 uL 95℃ 15s/50℃ 30s/72℃1 min
各反应液分别加逆转录酶 0.35 uL（5个循环）
DNA聚合酶1 uL
（混匀离心） 95℃ 10s/55℃ 40s(收集荧光)（45个循环）
于提取间，反应体系20 uL+模板RNA提取液5 uL。进行PCR扩增反应。阳性：Ct值＜35.0，并且呈现S形曲线, 阴性：Ct值为0。
1.3统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，用（x±s）表示，P＜0.05说明具有统计学意义。
2结果
2.1流感病毒核酸检测阳性率
2009年9月—2013年12月的2489件流感样病例咽拭子中，共检出流感病毒核酸阳性676件，阳性检出率为27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季节性甲3亚型病毒126件，占7.54%；季节性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。
2.2流感病毒流行特征
每年6~9月甲型H1N1病毒流感呈上升趋势，在10月~次年3月达到高峰期；6~9月以季节性甲3亚型病毒为主要流行病株，10月~次年3月甲型H1N1病毒成为主要流行病株。
3讨论
流感之一种急性呼吸系统疾病，主要由流感病毒引起，临床症状主要表现为高热、酸痛、乏力、呼吸道症状等。流感传染性强、潜伏期短、传播迅速，可分为甲、乙、丙三种类型，其中以甲型流感对人们的威胁最大[3-4]，因而必须加强对流感的检测和防控。
流感病毒致病能力较强，而且容易发生变异，而且人们对特异性菌株缺乏必要的免疫力，因而会导致流行暴发。相关研究表明，一场大型流感会导致整个地区的寿命降低[5]，因而必须加强流感的防控，为此我市疾病防控中心采用实时荧光定量PCR对流感病毒核酸进行检测，取得了良好的效果。
实时荧光定量PCR检测具有明显的优点，相比于普通的RT-PCR检测来说，其实验周期更短，灵敏度更低，而且不容易造成实验室污染[6]。实时荧光定量PCR检测能够利用PCR对DNA的高效扩增、光谱技术的敏感性和探针技术的特异性，敏感性较高，重复性好，而且更为直观，操作简单，容易操作，采用闭管检测对实验室的污染能够降到最低，因而具有良好的实用性；采用磁珠法进行提取核酸，能够最大限度的结合核酸，而且清洗效率高，能够实现自动化提取，操作方便[7-8]。
通过本研究发现，2009年9月—2013年12月共检出流感病毒核酸阳性676件，检测阳性率为27.16%；其中甲型H1N1病毒最多，各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，每年9月~次年的3月甲型H1N1病毒流感呈上升趋势。这充分证明了实时荧光定量PCR检测的优势。
但是在实验室检测中要注意以下几点：①要对实验室区域进行严格区分，不同实验区域采取不同的专属器械；②在样品提取后能够进行立刻检测的要进行立刻检测，否则会降低检验的准确率，如果无法立即进行检测要进行冷冻保存；③整个检测过程要在低温环境下进行；④移动液也进行严密的校准，操作过程要熟练，防止发生遗漏事件的发生；⑤要注重检测过程中的污染问题，采取75%的乙醇对实验台面进行擦拭，对周围环境采取紫外线消毒，以减少污染的发生[9]；⑥另外，相关研究也证明[10]，尽管检测流感病毒核酸的试剂和仪器很多，但是并不是所有的试剂与仪器都能达到的最好的匹配，因此，在进行实验室检测时还要多次进行校准试验，针对不同的试剂和仪器进行匹配性试验比较，找出最佳匹配方案，使实时荧光定量PCR的检测结果更加快速、准确，敏感性、特异性更高。
综上所述，实时荧光定量PCR是一种科学有效的检测方法，可对流感病毒核酸进行快速、准确的检测，分析流感病毒的流行规律，有效预防突发公共卫生事件的发生。
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参考文献]
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（收稿日期：2014-08-05）
