王超群，陈洪高，张运鹏
摘要： 利用羧甲基纤维素钠培养基，从腐烂苎麻秆堆中分离到１株高效纤维降解细菌，形态学观察结合１６Ｓ ｒＲＮＡ基因分子鉴定。结果表明，该菌属于蜡样芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ），发酵进行产酶的最适温度和ｐＨ分别为４２ ℃和７．０，在该条件下，于１００ ｍＬ发酵体系中发酵降解苎麻纤维，发酵９６ ｈ 后纤维素酶活力达到最高值２４．３ Ｕ／ｍＬ，发酵８ ｄ后其纤维降解率为45.1%。
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关键词 ：苎麻纤维；纤维素酶；１６Ｓ ｒＲＮＡ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ
中图分类号：Ｓ５６３．１文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０3－0565－０4
随着石油资源的日益枯竭、全球能量的需求持续增长和城市空气污染的日益严峻，可再生燃料和燃烧后释放温室气体较少的生物燃料正在成为化石燃料的理想替代品。纤维素是地球上最丰富的可再生有机物资源和重要的生物能源原料。芒草、麻类作物、作物秸秆和木材废料等都含有丰富的纤维素成分［１］，作为第二代生物能源技术，欧美各国正在将纤维资源利用重点研发［２］。
纤维素酶（CMC）是实现纤维素降解的关键酶，只有纤维水解成了可溶性糖，才能被微生物发酵转化成生物能源［３］。由于真菌纤维素酶不如细菌纤维素酶那么复杂，容易分离纯化，目前主要用真菌来生产纤维素酶，如木霉、曲霉、青霉、根霉和漆斑霉等［４］。然而，细菌纤维素酶也具有其独特的优势，如：细菌生长较快，比真菌更容易重组出较高产率的纤维素酶；细菌纤维素酶虽然复杂但同时也赋予其更多功能，在降解纤维时能够很好地协作；细菌纤维素酶比真菌纤维素酶更能适应酸、碱、热、盐等极端环境，具有更广泛的工业应用前景。因此，细菌纤维素酶最近正受到越来越广泛的关注［５］。研究较多的产纤维素酶细菌主要有Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｒｅｍｏｃｅｌｌｕｍ和Ｐｓｅｕｄ-ｏｎｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，关于Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ降解纤维的报道并不多见。
本研究从腐烂苎麻秆堆中筛选出１株高效降解苎麻纤维的微生物，优化其发酵条件，研究其产酶特征，鉴定其种属，为苎麻生物量的高效利用探索途径。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１微生物从咸宁湖北新农生态麻业有限公司园区一个长期露天堆置的苎麻秆堆中收集正在腐烂麻秆残渣约２００ ｇ，立即带回实验室用５００ ｍＬ无菌水浸洗，然后用双层纱布过滤去除残渣，滤液４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，上清液作为菌源备用。
１．１．２培养基富集培养基：ＣＭＣ－Ｎａ １５ ｇ／Ｌ，K２ＨＰＯ４ １ ｇ／Ｌ， Ｎａ２ＣＯ３ ５ ｇ／Ｌ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１ ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１５ ｇ／Ｌ，酵母浸出粉１０ ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ ｇ／Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。
ＣＭＣ－Ｎａ分离培养基：羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）１５ｇ／Ｌ，酵母膏０．２ ｇ／Ｌ，KＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ， ＮＨ４ＮＯ３ １ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ／Ｌ，琼脂２０ ｇ／Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。
ＣＭＣ－Ｎａ筛选培养基：ＣＭＣ－Ｎａ １５ ｇ／Ｌ，KＨ２ＰＯ４ １ ｇ／Ｌ， ＮＨ４ＮＯ３ １ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ／Ｌ，琼脂２０ ｇ／Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。培养４ ｄ后用刚果红进行染色鉴定。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏３ ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ ｇ／Ｌ。
ＣＭＣ－Ｎａ发酵培养基：酵母膏０．２ ｇ／Ｌ，蛋白胨３ ｇ／Ｌ，ＣＭＣ－Ｎａ １０ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２ ｇ／Ｌ， KＨ２ＰＯ４ ４ ｇ／Ｌ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ／Ｌ， ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ ０．３ ｇ／Ｌ， ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。
苎麻纤维发酵培养基：苎麻纤维２０ ｇ／Ｌ，酵母膏 ４ ｇ／Ｌ，ＮＨ４ＮＯ３ ４ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．２ ｇ／Ｌ， KＨ２ＰＯ４ ４ ｇ／Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。（将除苎麻纤维之外的部分配成溶液储存，灭菌的苎麻纤维临用时加入。）
１．２方法
１．２．１富集培养取２０ ｍＬ菌原液接种到８０ ｍＬ富集培养基中，４２ ℃恒温培养４ ｄ。
１．２．２初筛取富集培养液稀释成１０－３、１０－４、１０－５，涂布于ＣＭＣ－Ｎａ固体培养基，每个稀释梯度涂布３个平板，４２ ℃恒温培养至长出菌落，然后在相同的培养基上通过反复划线分离单菌落。
水解圈试验：挑取分离得到的单菌落点种于ＣＭＣ－Ｎａ筛选培养基上，４２ ℃恒温培养３ ｄ，用１ ｍｇ／ｍＬ的刚果红溶液染色平板３０ ｍｉｎ，再用蒸馏水清洗，最后用１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液脱色３０ ｍｉｎ，以透明圈的直径和菌落直径的比值大小作为筛选标准，挑选比值较大的菌再进行划线分离，镜检确认为纯的单菌落后，接种于牛肉膏蛋白胨培养基上保存。
１．２．３复筛将筛选得到的菌种接种到ＣＭＣ－Ｎａ发酵培养基上，４２ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养４ ｄ，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，上清液作为粗酶液测定ＣＭＣ酶活。酶活测定采用３，５－二硝基水杨酸（ＤＮＳ）法［６］，取粗酶液０．５ｍＬ，加入１％ ＣＭＣ－Ｎａ溶液０．５ｍＬ，４５ ℃反应３０ ｍｉｎ，迅速加入１．５ ｍＬ ＤＮＳ，在１００ ℃沸水浴中反应５ ｍｉｎ，稀释至１０ ｍＬ，以在１００ ℃沸水浴中保温２０ ｍｉｎ失活的粗酶液作为空白，用葡萄糖制作标准曲线，在酶标仪上５４０ ｎｍ处测定吸光度，计算纤维素酶活。酶活单位定义为：每分钟水解纤维素产生１ μｍｏｌ葡萄糖所需要的酶量为１个酶活单位Ｕ。
１．２．４发酵温度与ｐＨ条件优化在试验中，温度设置３２、３７、４２ 和４７ ℃共４个梯度，ｐＨ设置６、７、８、９共４个梯度，每个温度－ｐＨ组合３次重复。发酵体系为：在２５０ ｍＬ三角瓶中，预加１００ ｍＬ ＣＭＣ－Ｎａ发酵培养基，按１０％（Ｖ／Ｖ）接种量添加菌种。将三角瓶置于不同的温度和ｐＨ条件下，１５０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养４ ｄ，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，上清液作为粗酶液测定ＣＭＣ酶活，取平均值用于比较分析。
１．２．５菌株生长曲线测定发酵体系同“１．２．４”，调节初始ｐＨ ７．０， ４２ ℃，１００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养，３次重复。在分光光度计上，用初始发酵液作为空白调零，在波长６００ ｎｍ下每隔１８ ｈ取培养液测定一次吸光度（ＯＤ６００ ｎｍ），连续测定１２６ ｈ。
１．２．６纤维发酵试验将初筛接菌种到１ Ｌ ＣＭＣ－Ｎａ发酵培养基上，４２ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养４ ｄ，培养液作为菌酶混合液备用。在２５０ｍＬ三角瓶中预加１００ ｍＬ苎麻纤维发酵培养基（含２ ｇ灭菌苎麻纤维），接种１０ ｍＬ菌酶混合液，于 ４２ ℃、１００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养。共接种３０瓶，从接种开始，每隔２ ｄ取出３瓶，用２００目筛过滤，滤渣先用稀盐酸和硝酸混合液冲洗，再用热水（８０～１００ ℃）冲洗干净，１０５ ℃烘干，称纤维残余重量，按如下公式计算失重率，试验持续９ ｄ。另外３瓶用于观测发酵过程中纤维素酶活力动态变化，每２４ ｈ检测 １次，直至试验结束。失重率及纤维素酶活力取平均值用于分析。
失重率＝［Ｇ１－Ｇ２］÷Ｇ１×１００％
式中，Ｇ１为纤维的初始重量；Ｇ２为微生物降解后剩余纤维重量。
１．２．７菌株分子鉴定用ＴａＫａＲａ细菌基因组ＤＮＡ小量纯化试剂盒提取细菌基因组总ＤＮＡ，细菌１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因通用引物进行ＰＣＲ扩增，通过１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因测序鉴定菌株。ＰＣＲ引物序列为：２７Ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′；Ｒ１４９２：５′－ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３′。ＰＣＲ扩增条件为：９５ ℃ ５ ｍｉｎ变性；９４ ℃ ４５ ｓ，５４ ℃退化４５ ｓ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物送至三博远志公司纯化后测序。对测序得到的１６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列进行ＢＬＡＳＴ分析，在ＧｅｎBａｎｋ中进行同源性比较，利用ＭＥＧＡ ５．０５软件构建系统发育树。
２结果与分析
２．１菌株的分离
经过富集培养、划线分离和水解圈试验，筛选出１株高产纤维素酶的细菌，编号为Ｊ０４。该菌在ＣＭＣ－Ｎａ筛选培养基上４２ ℃恒温培养３ ｄ，菌落直径与水解圈直径之比约为１∶４。在ＣＭＣ－Ｎａ发酵培养基上４２ ℃培养４ ｄ，纤维素酶活为２３．６ Ｕ／ｍＬ。
２．２菌株的形态特征
菌株Ｊ０４呈革兰氏阳性，直杆菌（图１ａ），菌落成短或长链排列。芽孢圆形，孢囊无明显膨大。菌落扁平，圆形或近似圆形，灰白色，不透明，边缘不规则，略有光泽，中部略凸起，表面较粗糙，似融蜡状（图１ｂ）。
２．３菌株发酵的最适温度与初始ｐＨ
由图2可知，当温度处于３７～４７ ℃范围时，发酵体系中能检测到较高的纤维素酶活力，其中以４２ ℃左右为最佳。在３７～４７ ℃的范围内，菌株在中性初始ｐＨ时产酶能力最强，但在ｐＨ ６～８能保持较高的产酶能力（大于１６ Ｕ／ｍＬ），说明该菌株有较强的环境适应能力。同时，试验结果还表明，当温度低于３７ ℃，或ｐＨ大于９时，菌株的生长和产酶将明显受到限制。
２．４菌株的生长曲线
菌株Ｊ０４在ＣＭＣ－Ｎａ发酵培养基中４２ ℃振荡培养，经过约１８ ｈ的缓慢生长期后，开始进入对数期生长（图３）。整个对数生长期经历了大约５４ ｈ，然后进入稳定期。累计培养１０８ ｈ后，菌群密度开始呈现出下降趋势。
２．５CMC酶活与纤维降解效果
将Ｊ０４接种到苎麻纤维发酵培养基中，４２ ℃培养至２ ｄ结束时检测到纤维素酶活开始上升，在持续急剧上升３ ｄ(第五天)后接近最大值（２４．３ Ｕ／ｍＬ），（图４）。纤维的降解速率与发酵体系中纤维素酶的变化密切相关，发酵２ ｄ时检测到有大约２．６％的纤维被降解，此后随着纤维素酶活的持续上升，纤维降解速率明显加快，在第六天结束时累计降解１８．８％，第八天结束时累计降解４５．１％，表明菌株Ｊ０４有较强的降解苎麻纤维的能力。
２．６菌株的１６Ｓ ｒＲＮＡ基因鉴定
测定序列长度为１ ４３７ ｂｐ，将该序列在ＧｅｎＢａｎｋ中通过Ｂｌａｓｔ进行序列同源性比较，发现该序列与Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎ Ｄ２６亲缘关系最近（表１），同源性达到９９％。选取以１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列同源性为基础排序的亲缘关系前１０位的菌株，同Ｊ０４一起构建系统发育进化树（图６），结果Ｊ０４处于一个单独分支上，说明菌株Ｊ０４具有相对独立的进化地位。结合形态学特征和１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析结果，可将菌株Ｊ０４初步鉴定为Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ。
３讨论
关于蜡样芽孢杆菌产纤维素酶的文献并不多见，Ｔｈａｙｅｒ［７］及Ｒａｍｉｎ等［８］从白蚁腔肠、Ｌｕ等［９］从植物堆肥中都曾分离到能产纤维素酶的蜡样芽孢杆菌，但这些研究多局限于菌种鉴定阶段，未见相关后续报道。Ｐｒａｋａｓｈ等［１０］从沼泽泥土中、钱林等［１１］从湖底沉积物中筛选到了蜡样芽孢杆菌，这些菌株虽然纤维素酶活力都较高，但实际降解滤纸纤维时表现并不理想。燕红等［１２］从土壤中分离到的蜡样芽孢杆菌对稻草表现出了较好的降解能力。本试验从苎麻腐烂堆中再次分离出了蜡样芽孢杆菌，该菌生产纤维素酶的能力超过了前述的报道，在实际降解苎麻纤维方面的表现也比较突出，兼具降解结晶和非结晶纤维的能力，加之其独特的进化地位，表明该菌株可能由于长期处于苎麻秆腐烂堆中而获得了驯化并累积了突变。
苎麻是中国传统的多年生宿根纤维作物，对土壤和肥水要求低，适宜种植区域广泛，每公顷年产干物质２２．５ ｔ以上，因而资源比较优势十分突出。然而，目前苎麻总生物量中只有１０％左右（韧皮纤维）被有效利用，７０％左右（麻秆和麻叶）被废弃。麻秆和麻叶均含有丰富的纤维成分，因此，苎麻纤维降解高效菌的开发，对于促进苎麻纤维加工废弃生物质的资源化利用具有十分重要的意义。
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