钼蓝比色法测定甜樱桃中还原型VC含量的条件优化

杨金凤ａ，ｂ，黄玉琴ｂ，呼丽萍ａ，ｂ

（天水师范学院，ａ．甘肃省大樱桃工程技术研究中心；ｂ．生命科学与化学学院，甘肃天水７４１００１）

摘要：采用钼蓝比色法测定甜樱桃中还原型ＶＣ含量，探讨了此方法的最佳测定条件。结果表明，钼蓝比色法的最大吸收峰为８５０ｎｍ，５％硫酸溶液和５％钼酸铵溶液的最佳用量分别为１．５０ｍＬ和３．００ｍＬ，最适反应时间为１４ｍｉｎ，在此条件下测得Ｒ２为０．９９８７。优化后的测定方法变异系数小于５％，平均回收率为９８．５２％，还原型ＶＣ含量在０．００～０．１２ｍｇ/５０ｍＬ内呈良好的线性关系。该方法准确、快速、稳定，适合少量和批量样品的测定。用此法测得天水甜樱桃样品中的还原型ＶＣ的平均含量为２．０３２ｍｇ/１００ｇ。

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关键词：钼蓝比色法；ＶＣ；甜樱桃

中图分类号：Ｏ６５７．３２文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）01－181-03

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.047

Optimizing the ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣｏｎｔｅｎｔｏｆＲｅｄｕｃｔｉｏｎ－ｔｙｐｅＶｉｔａｍｉｎＣｉｎＳｗｅｅｔＣｈｅｒｒｙ

ＹＡＮＧＪｉｎ－ｆｅｎｇａ，ｂ，ＨＵＡＮＧＹｕ－ｑｉｎｂ，ＨＵＬｉ－ｐｉｎｇａ，ｂ

（ＴｉａｎｓｈｕｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａ．ＧａｎｓｕＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＳｗｅｅｔＣｈｅｒｒｙ；ｂ．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｉａｎｓｈｕｉ７４１００１，Ｇａｎｓｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Mｏｌｙｂｄｅｎｕｍｂｌｕｅｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄｗａｓ used ｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒｅｄｕｃｅｄｖｉｔａｍｉｎＣｉｎｓｗｅｅｔｃｈｅｒｒｙａｎｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ of ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｓｔｒｏｎｇａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｔ８５０ｎｍ． Tｈｅｄｏｓａｇｅｏｆ５％ｓｕｌｆｕｒｉｃ－ａｃｉｄｓｏｌｕｔｉｏｎ，５％ｍｏｌｙｂｄａｔｅ－ａｍｍｏｎｉｕｍｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗｅｒｅ１．５０ｍＬａｎｄ３．００ｍＬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Tｈｅｏｐｔｉｍal ｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｗａｓ１４ｍｉｎ．Ｔｈｅｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｍｅｔｈｏｄｗａｓｌｅｓｓｔｈａｎ５%， with ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙ of ９８．５２％．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄ had ａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｉｎｔｈｅｃｏｕｒｓｅｏｆ０．００～０．１２ｍｇ/５０ｍＬ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓａｃｃｕｒａｔｅ，ｒａｐｉｄ，ｓｔａｂｌｅａｎｄｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎing ｓｍａｌｌ－ａｍｏｕｎｔａｎｄｂａｔｃｈｓａｍｐｌｅｓ． Tｈｅａｖｅｒａｇｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｒｅｄｕｃｔｉｏｎ－ｔｙｐｅｖｉｔａｍｉｎＣｉｎｓｗｅｅｔｃｈｅｒｒｙｏｆＴｉａｎｓｈｕｉｗａｓ２．０３２ｍｇ/１００ｇ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍｂｌｕｅｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄ；ｖｉｔａｍＣ；ｓｗｅｅｔｃｈｅｒｒｙ

收稿日期：２０１４－０３－１４

基金项目：甘肃省科技厅农业科技成果转化资金计划项目（１１０５ＮＣＮＥ１０９）；甘肃省国家星火引导计划项目（２０１２ＧＡ）

作者简介：杨金凤（１９７６－），女，甘肃甘谷人，讲师，硕士，主要从事植物营养和生态学方面的研究，（电话）１３９９３８８３９３１（电子信箱）ｓｘｓｕｓａｎ＠１２６．ｃｏｍ；

通信作者，呼丽萍，研究员，主要从事果树栽培技术研究，（电子信箱）ｈｕｌｉｐｉｎｇ＠１６３．ｃｏｍ。

目前，果蔬中还原型ＶＣ的测定方法很多，如高效液相色谱法［１－３］、荧光分光光度法［４－６］、原子吸收光谱法［７，８］、紫外分光光度法［９－１１］、滴定分析法［１２］、钼蓝比色法［１３－１５］等，其中，高效液相色谱法、荧光分光光度法和原子吸收光谱法要求样品的纯度较高，还需要有昂贵的仪器，无法应用普及；紫外分光光度法中２，４－二硝基苯肼比色法操作麻烦，耗时较长；２，６－二氯靛酚法操作简便且应用最普遍，但是药品价格昂贵，而且多数果蔬样品提取液都有颜色，使滴定终点不易确定，有的即使用脱色剂也很难脱色完全，且造成ＶＣ的损失；碘量法需标定碘液，比较麻烦、费时。相比之下，钼蓝比色法操作简便，不易受样品提取液颜色的影响，在有偏磷酸存在下，样品中的还原性物质对测定结果也无明显影响，专一性较强，反应迅速，反应产物较稳定。利用钼蓝比色法测定食品中还原型ＶＣ已有一些研究报道，但在实际应用中，有些试验条件、特别是关于最大吸收波长的报道很不一致［１６－１８］，因此，本研究对测定的最大吸收峰、钼酸铵和酸性介质的用量以及反应时间等条件作了进一步的研究，确定了钼蓝比色法测定甜樱桃中还原型ＶＣ的最佳实验条件。

１材料与方法

１．１材料与仪器

供试甜樱桃样品于２０１２年６月初采自天水师范学院植物园，品种为“美早”。

ＵＶ３０１０紫外分光光度计（日本日立公司）；ＦＡ１００４电子天平（上海越平科学仪器公司）。

１．２方法

１．２．１溶液配制 ①５％钼酸铵溶液：准确称钼酸铵２５．００ｇ，加适量水溶解定容至５００ｍＬ；②草酸－ＥＤＴＡ溶液：草酸０．０５ｍｏｌ/ｍＬ、０．２０ｍｏｌ/ｍＬＥＤＴＡ，精确称取草酸６．３００ｇ（含结晶水），ＥＤＴＡ０．０５８４ｇ，充分溶解并定容到１０００ｍＬ；③５％盐酸溶液：吸取５ｍＬ的浓盐酸稀释至１００ｍＬ；④５％硫酸溶液：吸取５ｍＬ的浓硫酸稀释至１００ｍＬ；⑤５％硝酸溶液：吸取５ｍＬ的浓硝酸稀释至１００ｍＬ；⑥偏磷酸－醋酸溶液：摇动溶解１５ｇ片状偏磷酸于４０ｍＬ醋酸中，稀释至５００ｍＬ，用滤纸过滤，取滤液备用；⑦标准ＶＣ溶液：准确称取６０ ℃真空干燥２ｈ的ＶＣ０．０５００ｇ，用上述配好的草酸－ＥＤＴＡ溶液定容于５００ｍＬ的容量瓶中，使标准溶液浓度达到１ｍｇ／ｍＬ；所用试剂均为分析纯，试验用水均为去离子水。

１．２．２样品处理及测定方法将样品用去离子水洗净后擦干、捣碎，准确称取１０．００ｇ于研钵中，加入１０ｍＬ草酸－ＥＤＴＡ溶液，快速研磨成匀浆后转入５０ｍＬ容量瓶，用草酸－ＥＤＴＡ溶液定容后用高速冷冻离心机以１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸取１０ｍＬ的上清液于５０ｍＬ容量瓶中，加入１．００ｍＬ的偏磷酸－醋酸溶液和２．００ｍＬ的５％硫酸溶液摇匀后，再加入４．００ｍＬ的钼酸铵溶液，用去离子水定容至５０ｍＬ，１５ｍｉｎ后以试剂空白为参照，在８５０ｎｍ处测定。

１．２．３试验设计 ①最大吸收峰的选择：准确吸取１．００ｍL的ＶＣ标准溶液于５０ｍｌ容量瓶中用去离子水定容，然后以去离子水为空白置于１ｃｍ石英比色皿中，在６００～１０００ｎｍ内进行连续光谱扫描，确定ＶＣ最大吸收峰；②钼酸铵用量的选择：分别吸取１．００ｍＬ的标准ＶＣ溶液于５０ｍＬ容量瓶中，加入１．００ｍＬ偏磷酸－醋酸溶液和２．００ｍＬ５％硫酸溶液，摇匀后分别加入１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５ｍＬ钼酸铵溶液，按试验方法进行测定，选出最适钼酸铵用量；③硫酸用量的选择：分别吸取１．００ｍＬ的标准ＶＣ溶液于５０ｍＬ容量瓶中，加入１ｍＬ偏磷酸－醋酸溶液，再分别加入０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ｍＬ５％硫酸溶液，摇匀后加入３ｍＬ钼酸铵溶液，按试验方法进行测定，分析酸度对反应的影响，选出最适酸液的用量；④反应时间的选择：吸取１．００ｍＬ的标准ＶＣ溶液于５０ｍＬ容量瓶中，加入１ｍＬ偏磷酸－醋酸溶液和１．５ｍＬ５％硫酸溶液，摇匀后加入３ｍＬ钼酸铵溶液，放置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０ｍｉｎ后，按试验方法进行测定，考察时间对反应的影响，选出最佳反应时间；⑤精密度和回收率的测定：准确称取１００ｇ甜樱桃，再加入一定量的草酸－ＥＤＴＡ溶液，经捣碎后移人50 ｍＬ容量瓶中定容、过滤，其上清液即为待测样品的提取液。吸取２．００ｍＬ的提取液，加入１．００ｍＬ的偏磷酸－醋酸溶液，５％的硫酸１．５０ｍＬ，摇匀后，加人３．００ｍＬ钼酸铵溶液，用去离子水定容至５０ｍＬ，１４ｍｉｎ后，测定吸光度，平行测定６次。吸取２．００ｍＬ的提取液加入标准溶液０．５０ｍＬ，其他试剂同上，定容到５０ｍＬ，１４ｍｉｎ后测定吸光度。

２结果与分析

２．１最大吸收峰的选择

吸收峰的大小决定着方法的灵敏度，只有选择合适的波长，才能减少系统误差，提高测定的准确度。由图１可知，随着波长的增大，蓝色络合物的吸光度先上升而后呈下降趋势，在８５０ｎｍ处有最大吸收峰，故本试验选择８５０ｎｍ为测定波长。

２．２钼酸铵用量的选择

由图２可知，随着钼酸铵用量的不断增加，吸光度不断增大，在３．００ｍＬ左右达到最大值，大于３．００ｍＬ后其吸光度略有下降，之后无明显变化，说明过量的钼酸铵对反应并无多大的影响，因此钼酸铵的最佳用量为３．００ｍＬ。

２．３酸度的选择

由图３可知，随着硫酸用量的不断增加，吸光度先呈直线增加，当硫酸用量超过０．６０ｍＬ后，吸光度虽有增加，但增加幅度减缓，在１．５０ｍＬ达到最大值，之后吸光度又有所下降，但下降幅度不大，也就是说硫酸在１．００～３．５０ｍＬ时吸光度较稳定。说明在此范围内有利于稳定抗坏血酸，促进钼蓝络合物的生成，使显色反应进行得比较彻底。但当硫酸的用量超过３．５０ｍＬ后，吸光度下降很快。这可能是溶液中酸度过大，使抗坏血酸过于稳定，从而减缓了显色反应，不能使钼酸铵充分显色的原因。因此，本试验５％硫酸溶液的适宜用量为１．５０ｍＬ。

２．４反应时间的选择

从图４中可以清晰看出，在１４ｍｉｎ之前，随着时间的延长，吸光度在不断增加，这是由于抗坏血酸与钼酸铵的反应不彻底，还没有达到颜色的最大强度；在１４ｍｉｎ时吸光度达到最大值，之后吸光度的连线近似直线，而且可以稳定在１４～２０ｍｉｎ，也就是说，在此范围内吸光度非常稳定，可以满足测定时间的要求，这同李军［１4］研究相符。故本试验的最佳反应时间为１４ｍｉｎ。

２．５标准曲线的绘制

在优化的试验条件下，分别吸取０．０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２ｍＬ的标准ＶＣ溶液于５０ｍＬ容量瓶中，加入１ｍＬ偏磷酸－醋酸溶液和１．５ｍＬ５％的硫酸溶液，再加入３ｍＬ钼酸铵溶液后定容并摇匀，放置１４ｍｉｎ后，以试剂空白为参照在８５０ｎｍ处测定其吸光度值。以标准ＶＣ溶液的浓度（ｍｇ／５０ｍＬ）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制曲线，得回归方程Ａ８５０ｎｍ＝０．４００２Ｃ，Ｒ２＝０．９９８７（图５）。结果表明，ＶＣ浓度在０．００～０．１２ｍｇ／５０ｍＬ内吸光度与ＶＣ含量呈良好的线性关系，服从比尔定律。

按制作标准曲线的方法对６个甜樱桃样品中还原型ＶＣ含量进行测定，３次重复，最终测定了甜樱桃还原型ＶＣ平均含量为２．０３２ｍｇ/１００ｇ。